反式乌头酸（trans-aconitic acid）是具有三个羧基和一个不饱和双键的C6小分子有机酸，被美国能源部列为具有应用潜力的30种生物基化学品之一，同时也被发现在农业线虫病害防治方面具有很好的效果，另外，作为被联合国粮农组织FAO和美国FDA等批准的食品添加剂具有很好的安全性，潜在应用前景巨大。反式乌头酸传统上主要是通过从甘蔗制糖过程中少量提取获得，随后开发的化学合成方法过程复杂、副产物多、得率低，这些工艺都无法实现大规模低成本生产，使得反式乌头酸未能形成大规模商业供应。原料可及性问题成为阻碍反式乌头酸下游应用开发的关键限制性因素。
微生物制造工程中心设计构建了高效合成反式乌头酸的微生物细胞工厂，联合山东鲁抗医药开发了发酵工艺并完成工程放大验证，实现了反式乌头酸的高效绿色生物制造，解决了关键的原料可及性困境，同时通过田间实验证明反式乌头酸可有效降低农业根结线虫的危害。该工作近日发表于国际权威期刊Metabolic Engineering 《代谢工程》（图1）。
图1 反式乌头酸的生物制造及作为杀线虫剂田间实验
首先，选择具有低pH耐受能力的产衣康酸土曲霉工业菌株作为底盘细胞，通过敲除顺乌头酸脱羧酶编码基因成功阻断了衣康酸的生物合成，构建同时大量积累顺乌头酸和反式乌头酸的第一代土曲霉工程菌株，总产量约10 g/L。然后，为了将顺乌头酸快速转化为反式乌头酸以避免进入TCA循环被消耗，通过筛选评估不同时间响应的强启动子、不同定向整合位点、不同底盘细胞和不同乌头酸异构酶元件，设计了异源重构乌头酸异构化模块的系列土曲霉菌株，获得了更高效的第二代产反式乌头酸细胞工厂，摇瓶发酵产量达到约20 g/L，反式乌头酸比例从57%提高到了90%（图2）。
图2构建产反式乌头酸的真菌细胞工厂
随后，在培养基优化过程中通过多组分筛选发现反式乌头酸发酵生产过程中的关键营养限制因子，并通过溶氧控制等条件优化开发了百升罐的发酵工艺，依托山东鲁抗产业化中试平台将工艺逐步放大优化到5吨罐，并完成20吨发酵规模的生产示范，发酵98小时反式乌头酸产量达到60 g/L（图3）。
图3 反式乌头酸发酵工艺从5吨到20吨工业规模放大及优化
植物寄生线虫是一种造成巨大农业经济损失的农业病虫害，其防治手段非常有限。山东鲁抗医药基于发酵生产的反式乌头酸开展了黄瓜线虫防治田间试验，结果显示使用反式乌头酸后根结线虫病造成的危害得到有效改善，反式乌头酸560g亩用量与当下主流化学杀线剂噻唑膦180g亩用量的防治效果相当，但使用成本显著低于噻唑膦（图4）。该项工作为植物寄生线虫防控这一世界性难题提供了新的解决方案。
图4 生物制造的反式乌头酸粉剂对根结线虫的田间防效实验
该工作利用合成生物学策略开发了能实现反式乌头酸大规模低成本生产的的绿色生物制造技术，为反式乌头酸杀线剂的开发奠定了基础，研究成果已经与山东鲁抗舍里乐药业完成技术转让。更重要的是，反式乌头酸原料可及性困境的突破，将推动反式乌头酸作为一种重要生物基化学品的下游应用技术开发，为生物基材料开发提供新选项。
微生物制造工程中心吕雪峰研究员和黄雪年研究员为本论文的共同通讯作者，耿策副研究员和鲁抗医药靳志刚为论文的共同第一作者。本研究获得了国家重点研发计划、中科院先导A专项、国家自然科学基金和山东省人才计划的支持。（文/图 耿策 黄雪年）
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.06.007
Geng C.#, Jin Z.#, Gu M., Li J., Tang S., Guo Q., Zhang Y., Zhang W., Li Y., Huang X.*, Lu X.*, Microbial production of trans-aconitic acid. Metabolic Engineering, 2023.
授权专利：
(1) 吕雪峰; 黄雪年; 耿策; 张伟; 一种产乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用, 2019-7-18, 中国, 专利号ZL 201910649851.1
(2) 吕雪峰; 耿策; 黄雪年; 王敏; 靳志刚; 曹海峰; 郭强; 李继彬; 一种高产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用, 2020-8-26, 中国, 专利号ZL 202010867102.9
(3) 吕雪峰; 黄雪年; 耿策; 唐慎; 靳志刚; 曹海峰; 郭强; 李继彬; 一种高产反式乌头酸的重组土曲霉菌株及其制备方法与应用, 2020-8-26, 中国, 专利号ZL 202010866757.4
(4) 吕雪峰; 耿策; 黄雪年; 靳志刚; 曹海峰; 郭强; 李继彬 ; 一种高产反式乌头酸的重组土曲霉及其制备方法与应用, 2020-8-26, 中国, 专利号ZL 202010866709.5
(5) 吕雪峰; 黄雪年; 耿策; 唐慎; 靳志刚; 曹海峰; 郭强; 李继彬 ; 一种高产反式乌头酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用, 2020-8-26, 中国, 专利号ZL 202010866728.8
