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葡萄糖是自然界含量最丰富的单糖,是细胞的基本能量来源,也是生物炼制工业的重要原料。目前,“植物-生物质-糖”路线在葡萄糖生产中占主导地位,然而该路线面临植物生长周期长、生物质采集半径大、预处理过程成本高等问题。针对日益加剧的全球气候危机与粮食短缺问题,发展高效、可持续的新型葡萄糖合成路线具有重要意义;在此背景下,利用二氧化碳直接合成葡萄糖的技术引起广泛关注。近年来,应用化学-生物化学、电化学-生物学以及体外级联酶促反应等手段,已经成功打通了二氧化碳向葡萄糖、葡萄糖前体以及葡萄糖衍生物的转化路线;然而,以光自养生物为底盘,基于天然光合作用过程直接实现葡萄糖合成的技术却尚未取得突破。
近日,青岛能源所微生物制造工程中心以蓝细菌为平台,应用合成生物技术和系统生物技术重塑聚球藻细胞的光合代谢网络,构建直接利用二氧化碳合成并分泌葡萄糖的细胞工厂,并揭示了决定葡萄糖高产和分泌的分子机制。该工作于2023年6月10日在《自然通讯》(Nature Communications)期刊上在线发表。
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图1. 葡萄糖激酶缺陷菌株的细胞生长(a)和葡萄糖分泌(b)
在植物和藻类的光合作用中,葡萄糖作为能量和碳素的载体而合成,并发挥着重要调节作用,葡萄糖的胞内积累会对光合活性形成显著的抑制;因此,光自养细胞中葡萄糖极少以游离单体的形式进行合成和积累。本研究中,研究人员以聚球藻PCC 7942为出发藻株,对其代谢网络进行分析后发现其基因组上存在两个葡萄糖激酶(Glucokinase)基因,可能对后续改造不利,因此对两个基因进行了敲除。聚球藻细胞代谢显示出对葡萄糖激酶活性的高度依赖性,经过反复传代和适应性进化后才分离获得葡萄糖激酶基因完全敲除的纯合重组藻株。出乎意料的是,该藻株直接具有了高效合成和分泌葡萄糖的能力,在柱式反应器中,其胞外葡萄糖产量达到1.5 g/L(占总葡萄糖产量的95%以上,比合成速率超出此前报道10倍),这意味着在未导入任何外源催化和转运模块的前提下,葡萄糖激酶的缺失直接“激活”了聚球藻中未知的葡萄糖合成和分泌机制。
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图2. 葡萄糖磷酸化系统缺失菌株中葡萄糖合成途径的验证
研究团队对聚球藻代谢网络进行分析,推测重组藻株中大量合成的葡萄糖可能来自蔗糖代谢途径,进而设计了一系列遗传改造实验,成功证实聚球藻PCC 7942中存在稳定运行的蔗糖代谢循环,葡萄糖激酶能够将蔗糖水解产生的葡萄糖磷酸化,使其重新进入中心代谢;而葡萄糖激酶活性的缺失阻断了该循环中葡萄糖的“再利用”并引发了后续的葡萄糖积累与分泌。此前,蔗糖合成被普遍认为是蓝细菌适应高盐胁迫的响应性保护机制,而本研究则刷新了对其机制与功能的相关认识。
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图3. 葡萄糖磷酸化系统缺失菌株中基因组变异(a),基因的上调表达(b)及蔗糖合成途径的“激活”(c)
研究团队对重组藻株进行测序,并结合靶向重构发现葡萄糖激酶缺失株基因组上synpcc7942_1161基因的一个单点突变(G274A)是实现葡萄糖大量分泌的关键。该突变导致synpcc7942_1161基因表达量大幅上调,并发挥葡萄糖外泌蛋白的功能,其效果甚至超过蓝细菌代谢工程领域经典的糖转运蛋白GalP。结合葡萄糖激酶缺失导致的代谢表型以及菌株构建过程推测,敲除葡萄糖激酶导致聚球藻细胞中葡萄糖积累,对细胞代谢和光合生理产生抑制,促使细胞基因组产生突变,其中synpcc7942_1161-G274A突变实现了葡萄糖外泌,解除了代谢压力进而实现了纯合藻株的获取。
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图4. 葡萄糖生产藻株的代谢工程改造(a)及培养条件优化(b)
研究团队对重组菌株的转录和代谢组学进行系统分析,制定了加强蔗糖合成途径、优化碳流分配的代谢工程策略,将重组藻株的葡萄糖产量提高至2 g/L,结合半连续培养策略,累积产量达到5 g/L。
该研究揭示了限制蓝细菌光驱固碳合成葡萄糖潜力的遗传与代谢因素,更新了对天然蔗糖代谢机制的认识,在没有异源催化或运输基因的情况下,通过葡萄糖激酶活性人工阻断和工程藻株基因组自发突变的结合,成功将光合作用固定的二氧化碳重定向至葡萄糖的合成和分泌途径中。基于相关发现构建了高效光驱固碳合成葡萄糖蓝细菌细胞工厂,并为未来发展更高效的葡萄糖定向生产技术及工业化利用奠定了基础。
微生物制造工程中心吕雪峰研究员和栾国栋研究员为论文的共同通讯作者,博士研究生张杉杉(已毕业)和孙佳慧为论文的共同第一作者。本研究获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中科院青年创新促进会、洁净能源创新研究院联合基金以及山东省人才计划的支持。(文/图 孙佳慧 栾国栋)
原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-023-39222-w.
Shanshan Zhang#, Jiahui Sun#, Dandan Feng, Huili Sun, Jinyu Cui, Xuexia Zeng, Yannan Wu, Guodong Luan*, Xuefeng Lu*. Unlocking the potentials of cyanobacterial photosynthesis for directly converting carbon dioxide into glucose. Nature Communications,14, 3425 (2023).
https://doi.org/10.1038/s41467-023-39222-w.